超分辨率显微成像技术

Super-resolution techniques

1. PSF：荧光光子被显微镜吸收后中继到SCMOS相机，系统对该脉冲信号的响应函数就是PSF注：FWHM为衍射极限注：(1).卷积(先积分再平移—为空间域)——每一个像素的灰度值，是PSF覆盖范围内的荧光信号权重的加和 (2).黄圈(低通滤波器)：截止频率，只能看到圈内的，圈外的高频信号丢失 (3)空间域(尺寸越小，空间频率的高频信号越多—如细胞核上的核孔难以看到)中——亮暗的对比即为高频(亮暗快变化【200nm以内】的空间信息)；对应到频率域中心为低频率。
2. Methods of super-resolution: ^a94920
   1. STED:蓝色为激发，橙色为受激辐射耗尽，使得点光源变小
   2. RESOLFT:光控荧光蛋白使得PSF缩小，缺点是会影响活细胞的状态【观察时间久】
   3. PLAM-单分子定位：少数荧光点亮—高斯拟合(所有荧光分子PSF，即少数荧光分子位置信息的叠加集合)
   4. 结构照明(SIM): ^d3e355
      • 原理：
        • 空间域上：普通显微镜的激发光是均匀的信号：照明(激发)光强(E) x 荧光分子的空间分布=荧光信号注：（1）k0—空间频率 （2）条纹的荧光信号：傅里叶变换中 +K0 原点 -K0的迁移(荧光系统的采集，发生K0平移后，可采集红圈范围内—三角函数的调至)注：最精细的条纹也位于红色实线，黄圈放大，使得更多高频信号被采集*！注：通过叠加已知的精细物体来分析未知精细的细节
        • 傅里叶域上：OTF覆盖体积的扩展

Experimental results of live cell imaging by SIM

1. 不同方法的区别：注：活细胞成像可避免固定带来的伪结果
2. (TIRF-SIM)全内反射照明：观察质膜附近骨架形成，囊泡释放、内吞等动态信息(活细胞观测)有优势
   1. 注：如何进一步提高分辨率？：更高阶的调制频率(2K0)的产生
   2. 如何拓展到三维成像？：光片照明方案——注：缺点在于会浪费大量荧光光子、失焦的背景会降低信噪比注：仅包含焦平面上下的激发

Metrics for comparing live cell performance across SR methods

1. 成像过程：注：对低频信号是100%透过，即低通滤波的概念 (2)图像越小越精细，对比度(亮暗差别)越小，此时需要采集更高的信噪比注：OTF的引入拉大了分辨率(deconvolution)
2. OTF：SIM有三个峰值(±K0、原点)，同等分辨率只需更少的荧光信号(高频信号透过率更高，利于活细胞成像，不易影响细胞活性——光毒性、光漂白)
3. Summary:注：200nm分辨率的显微镜也可以观察40nm物质的运动情况(大致轮廓)，但不能分辨它们的细节情况