整合荧光光谱

荧光光谱技术

1. 荧光激发和发射光谱注：电子在激发态(不同激发态有不同分子能级)能量的损失(Stroke‘s shift—有助于设计滤光片)为弛豫
2. 荧光激发和发射能级图注：(1)激发的电子总是通过电子弛豫回到S1 (2)同一个轨道不能出现自旋方向一致的电子，因此在三线态的电子被困住，不能回到基态，当电子自旋方向的翻转才能回到基态(磷光)
3. 辐射和非辐射衰变：注：(1)荧光淬灭剂——原理是撞击淬灭，即与分子碰撞后能量转移 (2)内部转化：荧光分子的异构化，能量转移给水分子 (3)能量转移：如Fret (4)自由电子：电子摆脱原子核的束缚
   1. 光量子效率(非辐射途径的存在)
   2. 荧光寿命(易受荧光分子所处的微环境所所影响)：电子在激发态停留的平均时间注：只有Ki【非辐射衰减】受环境影响，如溶液环境等——利于探索细胞内部微环境注：100个脉冲激发一个光子的效率(降低激发效率)——单光子的激发；若可测量一个荧光分子与脉冲的距离时间，这就是单光子荧光寿命注：右是利用相位差代表荧光寿命

荧光寿命成像

1. Why需要荧光寿命成像：注：荧光寿命假色成像：蓝色到红色，荧光寿命由低到高
2. 荧光寿命成像显微镜：通过荧光寿命成像找出磷脂筏的区域

荧光共振能量转移

1. FRET：注：(1)能量转移效率与两分子距离有关 (2)KD/KA包括辐射和非辐射途径 (2)FD，只有Donor的荧光强度；FDA，有donor和acceptor时的荧光强度 (3)FRET检测的空间尺度恰好是生物大分子的尺度注：κ是方向指标，donor的发射偶极子和吸收偶极子的方向(更倾向发射或者吸收的方向)；κ平方为2/3时表示供体分子和受体分子方向随机注：(1)供体具有较高的量子产量 (2)供体发射光谱和受体激发光谱之间有大量的光谱重叠 (3)供体和受体的激发偶极子可以正确地对齐 (4)供体和受体在适当的福斯特距离上。
2. 检测直接的分子相互作用(10nm以内)：
   1. 例：SUMO和UBC9(基于荧光强度的转移效率)
   2. 活细胞研究(荧光寿命检测转移效率)：注：荧光信号在空间上的共定位不可证明二者存在分子相互作用(200nm左右)注：2号是过表达，可看到供体的荧光寿命变短，受体的荧光寿命变长
   3. 分子构象变化的研究：注：20ns——40ns注：通过荧光共定位，不可看结构信息的变化，通过荧光寿命的变化才可。注：交替激发可计算单分子的荧光效率注：荧光寿命越短，FRET效应越明显，有三个荧光寿命不一定代表三个构象，还受微环境影响。

荧光漂白恢复

1. 原理：
2. 实验流程：注：淬灭后用的光强弱且短
3. 定性定量分析：注：不可恢复说明荧光分子不运动，非自由扩散，如与细胞骨架结合的荧光蛋白。
4. 应用：
5. 相关技术：注：FLIP——未淬灭区域信号的减弱，可验证结构是否互连互通注：光激发研究膜转移(高尔基体到细胞膜的转移)
6. 总结：

荧光相关光谱

1. FCS发展历程：
2. FCS技术检测浓度：注：检测体积是飞升级别(线粒体的体积10^-15升)注：自相关分析——把随时间的变量变成函数，把背景干扰去除了注：粒径变化——检测相互作用注：时间尺度上的共定位，同一时间检测到两个分子注：荧光分子需要抗淬灭注：随着抗体浓度的提高，衰减变慢
3. 总结：

全参数荧光检测

1. 荧光显微成像和荧光光谱分析
2. 科学问题：
3. 应用：注：盐浓度影响的是LF
4. 总结：每个光子的信息都很重要，代表不同的故事