1.发展历程：优势在于电子的短波长，从而达到高分辨 
2. 例：
1. 神经元的突触：
2. 肌纤维：
3. 基本功能：对细胞基本结构的成像
4. 重要技术：
1. 三维重构方法：电镜解析三维结构
注：为什么用光不能做衍射来解析三维结构？——普通的光，比如可见光或红外线，波长较长，无法穿透蛋白质分子的微观结构，因为蛋白质分子的尺度非常小，通常在纳米级别。这种波长的光线的大小远远大于蛋白质分子的尺度，所以无法提供足够的分辨率来解析或观察蛋白质的三维结构。 为了解析蛋白质的三维结构，科学家们通常使用一些高分辨率的技术，比如X射线晶体学、核磁共振（NMR）和电子显微镜等。这些技术能够提供足够小的波长或者高能量的粒子，能够穿透和与蛋白质分子进行相互作用，从而得到高分辨率的结构信息。
2. 单颗粒技术：单分子不同角度的拍摄——重构结构(病毒和小蛋白)
关键技术：快速冷冻技术、场发射技术、相机(灵敏度要高)
3. 细胞原位冷冻电镜三维结构：冷冻固定瞬时原有状态，分析并解释结构所发挥的功能
4. 大尺度三维重构技术：
5. 研究对象：结构生物学(冷冻)、细胞生物学(超薄切片)——大分子、细胞结构
6. Why电镜？
1. 分辨率：
2. 电子的特性：
注：电压低，衬度好
3. 总结：
注：(1)EELS——解析元素和价态(材料学用的较多) (2)衍射：结构
透射电子显微镜
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电磁透镜原理：电子进入磁场进行偏转，受洛伦兹力螺旋前进，穿过磁场最后汇聚一点(磁场不同汇聚点短，汇聚点的长短就是焦距)
注：1.真空一般在-3—-5pa(样品处) 2.螺旋线透过透镜——像的方向任意，不是倒立的(调整倍数时会旋转——因此不同的倍数均保证了图片尽量不旋转)。3.不利：无凹透镜难以消除像差 -
电子与样品透射射的过程：能量不损失的电子(弹性散射)有利于成像，且一次散射很关键，透射电镜收集透射电子和弹性散射电子，扫描电镜收集二次电子和背散射电子的信息
注：透射束是一个圆点(无任何散射)，外围的圆环(各项同性的多晶)，点(各向异性的单晶)
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透镜系统：包含电子光学系统、真空系统、成像系统。包含放大成像模式、电子衍射模式、扫描透射模式（STEM）。
- 电子光学系统：电子先汇聚成点后扩散成面(第一聚光和第二聚光镜)
注：(1) 3：加速电子 (2) 4、5：将电子束合轴(通过偏转线圈实现) (3)9、10：聚光镜到物镜的合轴 (4)13(物平面)、14(像平面) (5)第二级聚光镜：扩束(放大)照明
- 灯丝：
注：电子可通过加热或者电场逃逸出，解结构要用场发射(激光光源)
注：饱和时，灯丝像为圆斑；不饱和时需要对中，再进行加热达到饱和。 - 聚光镜：上级是聚合缩小成一个点光源(也可以影响亮度)，第二聚光镜(越大越暗，越小越亮)是扩束(调节照明面积)，限制照明亮度(强度)给聚光镜加光阑。
注：第一聚光镜(原理是成像)，得到更小的点光源(越小越好——调节放大倍数)，亦可调节亮度
注：点光源出来后是发散的，第二聚光镜将点光源变成平行束照在样品上(调节也可发散、汇聚、平行，也可汇聚成点)
- 物镜：物到后焦面(物镜光阑：提高衬度，因为散射变少了)是一个傅里叶变换的过程，当插入物镜光阑以后，高频衍射点会被挡住，这样只有低频衍射斑会发出衍射电子束在像平面上成像。所以插入物镜光阑的第一个效果就是降低了成像的分辨率，因为携带样品细节信息的衍射光被物镜光阑挡住了。但是，插入物镜光阑也是有优点的：可以提高成像对比度。
- 物镜聚焦：
注：离焦成像要清楚一些，通常用欠焦(牺牲分辨率提高衬度，高频信号吸收的更多)，过焦不真实。
- 物镜的几何相差：球差(电镜通常消除不了)、色差(波长不同——加速电压能量有所差别)、慧差(入射光斜着入射——任何一个电镜都可以矫正)、像散(透镜不同方向聚焦能力不均一；聚光镜像散指的是汇聚能力弱时，变宽变椭，物镜则是圆环变椭)和畸变
- 物镜聚焦：
- 投影镜(物平面)：逐级放大
- 图像探测器：
注：(1)闪烁体（电子转换到光信号再转换成电信号）——DDD可直接接收电子转换成电信号，成像速度快。（2）相机越往下越大(如下图)
注：能放大多少倍？——显示的倍数不是实际的放大倍数(荧光屏和底片是准的放大倍数)，但需要看相机的位置(因此放大倍数需要算，通常会看像素的尺寸，分辨率也和像素尺寸直接相关)。
- 灯丝：
- 衍射花样怎么切换的？——中间镜的来回切换——二次放大，并控制成像模式（图像模式或者电子衍射模式）
注：中间镜的来回切换导致物距变大，但像距不变——切换衍射模式，即照相机对像平面进行对焦为成像模式，照相机对放大镜的后焦面上对焦，得到的是样品的衍射花样
- 为什么物镜之后的光路，光学显微镜和电子显微镜差别很大？——电子显微镜为电磁透镜
- 电子光学系统：电子先汇聚成点后扩散成面(第一聚光和第二聚光镜)
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生物电镜的核心问题
- 图像的衬度：
- 质厚衬度：透射电子数越多越亮，利于物镜光阑(只让透射电子通过)消除散射的电子
注：染背景是负染、染样品是正染 - 衍射衬度：近场近似(聚光镜的衍射——光斑)——Fresnel菲涅尔衍射；远场近似(物镜衍射——衍射花样）——夫朗和费衍射
注：利用物镜光阑取像，分析感兴趣的地方 - 相位衬度：电子束相位变化(不同散射角导致相移以及光程差的改变)——相消相长
- Z衬度：
注：Z代表原子数，电子束扫描样品表面的扫描。高角度非弹性电子的强度与Z^2成正比。因此，高角度环形暗场（HAADF）探测器接受这些电子
- 质厚衬度：透射电子数越多越亮，利于物镜光阑(只让透射电子通过)消除散射的电子
- 衬度传递函数(CTF)：
- 空间频率：背景低频(波长长)、精细的条纹是高频(波长短)，电镜的散射斑越外面越高频
- CTF：振幅变化量小，只看相位
注：0点——低频信息容易缺失(无信号)；振荡——边翻转(亮暗变化)边衰减，衰减到不能衰减时为分辨率极限【傅里叶变换变成环，中间空的为零点，暗的也是过零点，第一个过零点的为点分辨率】；先往下走是欠焦，往上走是过焦
- 空间频率：背景低频(波长长)、精细的条纹是高频(波长短)，电镜的散射斑越外面越高频
- 图像的衬度：
样品制备——超薄切片
- WHY？
- 样品制备步骤：
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- 取材：
- 固定：
注：多聚甲醛较温和，适用于冷冻电镜
- 脱水：树脂和水不相容，真空中不可有水
注：脱水的最后一步很关键 - 渗透：
- 超薄切片：一开始先进行半薄切片(100nm)
注：网孔数目越多越精细——300适用于解析蛋白结构
注：超薄切片常见问题-颤痕（切片厚度有规律的变化）、刀痕、空洞 - 染色：
- 取材：
- 成像步骤：
注：主要是振幅衬度、相位程度也有但少
电子断层三维重构技术
- 不同明暗相间的囊泡是同一个性质的囊泡吗？——三维重构(STEM-1-2um)
注：不同角度的信息越多越精细 - 电子断层扫描成像技术条件：
- 加速电压：厚度变时，加速电压也需要变
- 物镜极靴间距和样品台倾转稳定性：角度旋转的精细化
- 样品杆：
注：单轴最常用，双轴便于构建3D结构，但是容易变形
注：低角度的最有意义
注：光轴和机械轴不重合造成图像偏差，解决方法便是通过硬件调整使二者重合(此外还可以通过软件进行调整——图像的互相关分析，可分析图像往哪个方向移动，最后调整样品台使得目标移动到中央；自动聚焦可修正欠焦或过焦，图像摆动幅度变小时就是聚焦)，如下
- 载网孔太小利用的有效空间会变小
- 采集图像：需记录放大倍数、像素大小以及倾斜角度等参数。
- 加速电压：厚度变时，加速电压也需要变